莱菔子水溶性生物碱对自发性高血压大鼠降压作用的实验研究

实验研究

莱菔子水溶性生物碱对自发性高血压大鼠

降压作用的实验研究

李铁云1 , 李天国1 , 张国侠1 , 郭鸿雁1 , 柳静1 , 李炳根1 , 朴中云1 , 盖国忠2

1.长春中医药大学, 吉林长春 130117

2.吉林省中医院, 吉林长春 130021

[ 摘要] 目的:探讨莱菔子水溶性生物碱对自发性高血压大鼠(SH R)的降压作用以及对大鼠血清一氧化氮

(N O)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(M DA )及心肌一氧化氮合酶(N O S )活性的影响。方法:将 40 只 S H R 随机分为 5 组:空白对照组、莱菔子水溶性生物碱高、中、低剂量组、卡托普利组, 每组 8 只。采用尾动脉测压法测量给药前及给药后 2 、4、6 、8 w 大鼠收缩压, 于给药 8 w 后, 检测大鼠血清 N O 含量, SO D 活性, MDA 含量以及心肌 N OS 活性。结果:给药 8 w 后, 莱菔子水溶性生物碱明显降低了SH R 的血压, 其中高、中剂量组的降压幅度与卡托普利组比较无显著性差异, 同时莱菔子和卡托普利均能增加大鼠心肌 N O S 活性和血清 N O 含量, 并且莱菔子水溶性生物碱能显著提高大鼠血清 SOD 活性, 降低 M DA 含量, 而卡托普利

此作用不明显。结论:莱菔子降压作用可能与激活了 N O-N O S 系统有关, 并可能通过抗氧化起到保护靶器官的作用。

[ 关键词] 莱菔子水溶性生物碱;一氧化氮;一氧化氮合酶;超氧化物歧化酶;丙二醛

[ 中图分类号] R285.6 [ 文献标识码] A [ 文章编号] 1673-6613(2007)01-0025-04

Experimental Study of Hypotensive Effect of Soluble Semen Raphani Alkaloids in Spontaneous Hypertensive Rats

Li Tieyun1 , Li Tianguo1 , Zhang Guoxia1 , Guo Hongyan1 , Liu Jing1 , Li Binggen1 , Piao Zhongyun1 , Gai Guozhong2 1.C hang chun U niv ersity of Tridional Chinese M edicine, C hang chun, Jilin 130117, C hina

2.Jilin H o spitol of traditio nal Chinese M edicine, Changchun, Jilin 130021, China

[ Abstract] Objective:To explore the effects of the soluble Semen Raphani alkaloids on spontaneous hy- pertensive rats (SHR), their serum nitric oxide (NO)content, superoxide dismutase (SOD)activity, con-

tent of malondialdehyde (MDA)and cardiac nitric oxide synthase (NOS)activity.Methods:Forty SHRs were randomly divided into five groups:untreated control group, the high, middle, low dosage group of the Semen Raphani soluble alkaloids, and Captopril group, with eight rats in each group.SBP were measured respectively by tail-cuff technique before therapy and two weeks, four weeks, six weeks, eight weeks after therapy.The serum content of NO, activity of SOD, content of MDA and activity of NOS in cardiac tissue were measured after eight weeks therapy.Result:Eight weeks treatment later, the soluble alkaloids of Semen Raphani significantly declined the blood pressure of rats.Compared with that of Cap- topril, the hypotensive function of high and middle dosage groups had no significant diference.Mean- while, both Semen Raphani and Captopril significantly enhanced serum NO content and cardiac NOS activ- ity of SHRs.Besides, Semen Raphani decreased their serum MDA content and enhanced SOD activity greatly, while Captopril had no this effect .Conclusion:The hypotensive function of the Semen Raphani

may be related to its NO-NOS system activation, and may protect target organ via antioxidation. [ Key words] Soluble Semen Raphani alkaloids;Nitric oxid;Nitric oxide synthase;Superoxide dismutase; Malondialdehyde

[ 作者简介] 李铁云(1975-), 女, 医学博士。研究方向:中医药治疗高血压病

高血压病的发生和演变是多因素、多层次的复杂过程, 不仅存在血液动力学异常, 还存在糖、脂肪等代谢紊乱及伴随心、脑、肾等靶器官的不良重塑。

现代研究认为对高血压病的治疗并非只是单纯强调降压, 而是**限度地降低心血管病的死亡和病残的危险。近年来, 高血压与氧自由基、N O 的关系成为人们研究的热点。 N O 是内皮源性血管舒张因子 (edo thelium-derived relaxing facto r, ED RF ), 在高

血压的发生和发展中起着重要作用, 目前已知高血压病人和动物存在内皮功能障碍, 使内皮源性血管舒张因子生成减少, 而血管舒张因子生成减少又可加重高血压, 形成恶性循环。同时, 大量的临床与动物实验研究也表明高血压患者和动物存在氧自由基损伤反应, 而自由基损伤又可能通过多种途径参与高血压及靶器官损害的演变进程。因此, 目前提倡在治疗高血压病时注意保护内皮和抗自由基损伤的

治疗。

莱菔子是十字花科植物萝卜 (Raphanussati -

vus L .)的干燥成熟种子, 性味辛甘平, 归肺脾胃经, 具有降气化痰, 消食除胀之功效。近年来研究表明莱菔子有较强的降压作用, 其有效成分包括辛烯醛、邻苯二甲酸丁二酯[ 1] 和芥子碱硫酸氢盐[ 2] ;其作用机理研究表明莱菔子水醇提取液是通过直接扩张血管, 并部分通过中枢神经系统发挥降压作用[ 3] 。本

实验通过观察莱菔子有效成分水溶性生物碱对自发性高血压大鼠 (spont aneous hy pert ensive rat s, S H R)的降压作用, 以及对大鼠血清 N O 含量、超氧化物歧化酶(SO D)活性、丙二醛(M DA )含量和心肌 N OS 活性的影响, 探讨莱菔子的作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物自发性高血压大鼠 (SH R )40 只, 雄性, 12 w 龄, 体重(265 ±20)g , 清洁级, 购自北京维通利华公司, 合格证号 SCXK (京)2002-2003。适应性喂养 1 w 后进行实验。

1.1.2 药品与试剂莱菔子水溶性生物碱, 由吉林省中医中药研究院新药中心制备。 N O 试剂盒、 N OS 试剂盒、M DA 试剂盒、SO D 试剂盒及双缩脲蛋白试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供, 批号:20060718。

1.1.3 主要仪器 RBP-1B 型高血压大鼠测压仪, 北京中日友好医院生产;日本岛津 U V -2450 型紫外

分光光度计;美国 5W -CJ-IF 高速冷冻离心机。 1.2 实验方法

1.2.1 莱菔子水溶性生物碱的制备制备方法参

照文献[ 4] , 生莱菔子经水提、70 %醇沉, 得稠膏状提取物, 用稀氨水溶解, 氯仿萃取, 碱水层用盐酸调 pH 值为 2 ~ 3, 滤去不溶物, 加雷氏铵盐溶液至沉淀完全, 沉淀加少量水洗涤, 抽干, 用丙酮溶解, 过滤, 滤液通过中性氧化铝柱, 流出丙酮液加饱和硫酸银溶液, 滤液减压回收丙酮, 析出红棕色结晶, 经理化和光谱分析主要为芥子碱硫氰酸盐。

1.2.2 动物分组及给药将 SH R 随机分为 5 组, 空白对照组8 只, 每日灌服饮用水;莱菔子高、中、低剂量组(简称高、中、低剂量组)各 8 只, 每日分别按 45 mg/ kg 、30 mg/ kg 、15 mg/ kg 灌服莱菔子水溶性生物

碱(分别相当于生药 30 g/ kg 、20 g/ kg 、10 g/ kg);卡托普利组 8 只, 每日按 20 mg/ kg 灌服卡托普利。每只大鼠按 10 mL/ kg 给药或水, 每周测量一次体重, 并且依据体重调整给药剂量。实验期间各组均饲以普通饲料, 并自由饮水, 给药时间为 8 w 。

1.2.3 血压测定使用 RBP-1B 型测压仪测量大鼠尾动脉收缩压, 给药期间 2 w 测一次血压, 每次测 3 个值, 取平均数。

1.2.4 血清及心肌样本采集和检测给药 8 w 后, 于末次给药后将动物禁食 12 h, 称重, 乌拉坦麻醉, 腹主动脉取血处死动物, 制备血清, 采用硝酸还原酶法检测血清 N O 含量, 硫代巴比妥钠(T BA)微量法检测MD A 含量, 黄嘌呤氧化酶法检测 SO D 活性。

取左心室心尖部相同部位心肌组织 100 mg , 用生理盐水制备成 10 %的组织匀浆, 用化学比色法检测 N O S 活性, 蛋白浓度测定采用双缩脲法。

1.2.5 统计方法

实验数据均采用均数 ±标准差(x±s)来表示, 运用 SPSS13.0 软件进行计算, 组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 莱菔子水溶性生物碱对 SH R 血压的影响

治疗 8 w 后, 莱菔子水溶性生物碱各剂量组及卡托普利组均明显降低了 S H R 的血压, 各治疗组与空白对照组比较均有显著性差异(P<0.05, P< 0.01), 结果见表 1。

治疗 4 w 后大鼠血压与治疗前差值比较, 莱菔子各组与卡托普利组均有显著性差异(P<0.05, P <0.01), 治疗 8 w 后莱菔子水溶性生物碱高、中剂量组与卡托普利组无显著性差异(P>0 .05),低剂量组与卡托普利组仍有显著性差异(P<0 .01), 结果见表 2。

表 1 各组治疗前及治疗后 2、4、6、8 w 血压情况比较 (x±s, mmHg)

组别空白对照组	n 治疗前 8 176.33 ±2.94	2 w 177 .67 ±2 .88	4 w 177 .17 ±5 .00	6 w 177.50 ±3.73	8 w 178 .5 ±3.99
高剂量组中剂量组低剂量组卡托普利组	8 176.63 ±4.10 8 176.38 ±4.34 8 175.13 ±5.28 8 175.29 ±5.77	162 .13 ±4 .91 ＊＊ 166 .38 ±7 .17 ＊＊ 171 .75±2 .43 ＊ 147 .71 ±4 .31 ＊＊	156 .50 ±3 .70＊＊ 158 .38 ±8 .19＊＊ 168 .50 ±2 .20＊ 144 .29 ±5 .85＊＊	153.50 ±2.78 ＊＊ 154.88 ±3.40 ＊＊ 164.13 ±1.96 ＊＊ 142.14 ±4.63 ＊＊	147 .38 ±2 .26 ＊＊ 149 .38 ±3 .07 ＊＊ 160 .25 ±2 .87 ＊＊ 142 .00 ±5 .74 ＊＊

注:与空白对照组比较, ＊P<0 .05, ＊＊P<0.01

表 2 治疗 4、8 w 后血压差值比较 (x±s, mm Hg)

组别	n	4 w	8 w
空白对照组高剂量组	8 8	-0.83±5 .15 20.13 ±5.33 ＊＊■■	-2.17±3 .82 29.25 ±4 .92＊＊
中剂量组	8	18.00 ±6.68 ＊＊■■	27.00 ±5 .83＊＊
低剂量组	8	6.63 ±4.69 ＊■■	14.88 ±3 .60＊＊■■
卡托普利组	8	29 .57 ±7 .89 ＊＊	31.86 ±5 .05＊＊
注:与空白对照组比较, ＊P<0 .05, ＊＊P<0 .01;与卡托普利组比较, ■■P<0 .01 2.2 莱菔子水溶性生物碱对 SH R 心肌 N O S 活性和血清 N O 含量的影响莱菔子高、中剂量组及卡托普利组均能明显升高大鼠心肌 NOS 活性,其中高剂量组明显优于卡托普利组(P<0.05);并且各治疗组均能增加大鼠血清 NO 含量, 以高剂量组*为明显(P<0.01),但莱菔子各组与卡托普利组比较无显著差异(P>0.05),结果见表 3。表 3 各组对心肌 NOS 活性和血清 NO 含量的影响 (x±s)
组别	n	NO S(U/ mgpro t)	N O(mmol/ L)
空白对照组高剂量组中剂量组低剂量组卡托普利组	8 8 8 8 8	0.253±0.033 0.319±0.029＊■ 0.291±0.017＊ 0.274±0.022 0.283±0.024＊	60 .99 ±9 .37 72 .39 ±5 .57 ＊＊ 69 .16 ±5 .09 ＊ 68 .47±6 .55 ＊ 68 .96 ±6 .5＊
注:与空白对照组比较, ＊P<0 .05, ＊＊P<0 .01;与卡托普利组比较, ■ P<0.05 2.3 莱菔子水溶性生物碱对 SH R 血清 SO D 活性和 MD A 含量的影响莱菔子各剂量组均能明显降低大鼠血清 M DA 含量(P<0.01 ), 同时显著升高 SOD 活性 (P< 0.01),而卡托普利此两项作用, 结果见表 4。表 4 各组对血清 SOD 活性和 MDA 含量的影响 (x±s)
组别 n		SOD(U/ mL) M DA (nmo l/ mL)
空白对照组	8	119 .08±39 .82 9.91 ±1 .79
高剂量组	8	161 .01 ±11 .23＊＊■ 3.39 ±1 .42＊＊■■
中剂量组	8	155 .43±14 .12＊＊ 4.57 ±0 .90＊＊■■
低剂量组	8	155 .05 ±7 .49 ＊＊ 5.22 ±1 .98＊＊■■
卡托普利组	8	136 .27 ±33 .29 8.64 ±3 .56

注:与空白对照组比较, ＊＊ P< 0.01;与卡托普利组比较, ■ P<0.05, ■■P<0 .01

3 讨论

SH R 是一种遗传高血压模型, 与人类的原发性高血压相似。现代研究认为, 高血压病人和动物存在内皮功能障碍和自由基损伤, 高血压致内皮功能障碍的机制可能有多方面, 其中*主要的是氧化应

激产物降解 N O。大量的临床与动物实验研究表明, 在高血压的病理生理状态下, 体内氧化应激增强, 氧自由基(O F R)生成增加, SO D 活性明显减低。大量的O F R 可使细胞膜脂质过氧化, 从而破坏细胞膜的不饱和脂肪酸, 形成脂质过氧化物(lipid per- oxi de, L PO)。MDA 是 LP O 的一类终末代谢产物,

测定 MDA 含量可间接反映体内脂质过氧化反应程度。而 SO D 是天然的抗氧化酶, 可通过催化超氧阴离子自由基的自身氧化还原反应, 有效地清除自由基, 维持体内自由基的动态平衡, 以避免损伤机体的组织细胞。 NO 是内皮依赖性舒血管物质, N O S 是 N O 合成的**限速酶, N O 作为一种新型生物信息递质, 除具有扩张血管、降低血压、松弛平滑肌等活

性外, 尚具有免疫调节、抗氧化损伤[ 5] 、抑制平滑肌细胞的慢性增殖, 参与血管重建等生物活性[ 6] 。因此, 保护内皮功能、减少自由基损伤对治疗和预防高

血压靶器官损伤具有深远意义。

芥子碱(Sinapi ne)是莱菔子降压的有效成分, 它是广泛存在于十字花科植物中的一种季胺盐物质, 近年来的研究揭示芥子碱是一种非常有价值的天然抗氧剂, 具有清除超氧阴离子自由基和羟自由基的功能和抗衰老的作用[ 7] , 此外还具有抗辐射[ 8] 、抗炎[ 9] 等作用。对于芥子碱盐的形成, 有硫氰酸盐和硫酸氢盐两种说法, 本实验证明, 从莱菔子中提取的水溶性生物碱, 其主要成分为芥子碱硫氰酸盐, 这与谭鹏等[ 10] 的文献论述相一致, 考虑硫酸氢盐可能为特定提取工艺、精制过程中的次生物。实验结果

表明, 以芥子碱为主要成分的莱菔子水溶性生物碱具有明显的降压作用, 其中高、中剂量组与卡托普利组比较无显著性差异, 同时能显著增加大鼠血清 N O 含量, 提高心肌组织 N O S 活性。此外, 莱菔子组尚能增加大鼠血清 SO D 活性, 降低 MD A 含量,

具有较强的清除氧自由基, 抗氧化损伤的作用, 而卡托普利没有明显的抗氧化作用。

新近, Muhammad[ 11] 等通过离体实验证明莱菔子粗提物(包括黄酮、生物碱、苯酚等)具有内皮依赖的扩血管作用, 此作用被一氧化氮合酶(N O S)抑制

剂 NG -硝基-L-精氨酸甲酯(L-N A ME)阻断, 在剥去内皮时也完全消失。同时证明该提取物能引起血压下降, 心率减慢, 心肌收缩力减弱等一系列的心血管抑制效应, 该效应能够被 M 胆碱受体阻断剂阿托品完全阻断, 因此证明莱菔子是通过激活 M 胆碱受体介导心血管抑制作用的。同时, 我们也通过大鼠体内实验证实了莱菔子水溶性生物碱具有激活 N O- N OS 系统的作用, 由于 M 胆碱能介导的扩血管效应是由内皮释放 N O 引起的[ 12] , 因此我们的实验结果与M uhamm ad 的结论基本一致, 我们认为可能是芥子碱在胃肠道分解成芥子酸和胆碱, 胆碱激活了

N O-N O S 系统, 使 N O 合成增多, 从而使血管扩张,

血压下降。另外, N O 是一种理想的抗动脉硬化

(A S)因子, 提高 N O 浓度可改善血管内皮功能[ 13] 。

本实验结果也表明, 莱菔子水溶性生物碱具有较强的抗氧化作用, 抗氧化的同时也可以减少氧化应激产物对 N O 的降解, 从而保护血管内皮功能, 防止脂质过氧化引起的炎性反应, 延缓 A S 的发生和发展, 防止病情进一步加剧。因此, 莱菔子可能通过激活 N O-N O S 系统和抗氧化作用起到降压和保护靶器官的作用。

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(收稿日期:2006-1 1-02 修回日期:2006-11-26)

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中华中医药学会第十届中医药文化学术研讨会征文通知

中华中医药学会中医药文化分会拟于 2007 年 7 月下旬在湖南长沙召开“ 中华中医药学会第十届中医药文化学术研讨会”, 现将有关征文事宜通知如下:

一、征文内容

1.中医医德规范研究;2.中医药文化学术研究(中医药文化的定义、中医药文化的学科建设、中医哲学的内涵、中医药文化与中华传统文化、中医药人文精神与科学精神);3.中医药文化的应用研究(中医药文化与养生文化、中医药文化与临证思路);4.地域中医药文化与中医药企业文化建设;5. 中医药历史、古籍文献、文物及考古研究。