细胞化学和细胞内分子示踪技术

细胞示踪技术研究概述

摘 要从胚胎发育开始,动物细胞就在不断地迁移、分化,以实现协调、稳定的生命活动。细胞示踪技术在细胞或亚细胞水平上通过观察示踪细胞的活动,对动物活体实现动态观察。该技术对于研究细胞起源、了解组织器官发育过程以及探讨疾病的发生和发展机制都具有重要的意义，在医学、组织工程和发育生物学领域有着广泛的应用。本文对当前细胞示踪技术涉及的主要示踪标记物、标记方式和成像技术等的研究进展进行概述。

关键词 活体细胞示踪 谱系示踪 光学成像 组织工程

多细胞生物正常生命活动的维持和发展建立在体内各种器官组织中各自包含的种类繁多、数量庞大的细胞之间协调活动的基础上,细胞自胚胎发育开始就不断地迁移和分化,在生命个体活动中扮演着各自重要的角色。示踪各种组织细胞的活动，对于研究体内特定类型细胞的起源及命运、组织器官的发育过程、机体生理机制及疾病的发生和发展都至关重要。通过不同的标记物或采用不同的成像手段,研究者可以对同实验对象在不同时间点进行实时比较，也可以跟踪同一目标细胞在体内的动态变化。这种方法既可减少实验动物的数量,符合动物伦理要求,又可以使获得的数据更加真实、生动和可靠。目前,*新细胞示踪技术已经能实现对特定单个细胞及其所有后代细胞的分化和发育活动的追踪和观察( 即细胞谱系示踪),为细胞再生研究提供了新思路。细胞示踪技术已被广泛应用于干细胞治疗、基因功能研究、器官移植和新药研发等领域。

细胞示踪技术*早起源于 20 世纪初。早在1905年,Conklin 等利用柄海鞘胚胎早期分裂球着色差异对分裂球的发育过程进行观察,提出了“胞质决定子”的理论。Mio和Maeda 等使用慢速摄影技术实现对活体胚胎的示踪观察。此后,科学家尝试使用多种类型的标记物,通过物理的方式注入到细胞内对其进行标记追踪，并采用多种成像手段进行观察记录。本文就目前主流的细胞示踪技术使用的标记物、标记方式和成像技术三方面的研究进展进行概述.

1细胞示踪标记物

理想的细胞示踪标记物需满足三个要求:D标记物能明确标记初始时间点的细胞;2标记物仅保留在原始细胞及其后代中,不会扩散到邻近的细胞中;3标记物足够稳定,在细胞示踪期间对细胞无毒。根据标记物的种类可以分为外源性标记物和内源性标记物。

1.1 外源性标记物 外源性标记的实现比较容易，其主要方法是将标记物通过与细胞膜的吸附、扩散、内吞以及转运等方式,按标准流程简单孵化而导入细胞内

常见的外源性标记成像方式有:D荧光染料成像。由于荧光染料种类很多,且都是亲脂性的,故能吸附在细胞膜上,使标记细胞产生荧光而被检测到。但是,这种方法容易受到自发荧光的干扰,而且容易淬灭,背景信号较多,信噪比较差。(2量子点成像。量子点标记物般是直径在 2~100 nm 的接近圆球形的半导体粒子,具有荧光光谱窄、不易漂移、激发光谱宽、颜色可调、光化学稳定性高以及不易分解等优点。其发光强度是有机荧光染料的 20 倍稳定性是荧光染料的 100倍,不易被代谢,组织存留时间较长。量子点标记物已经成为活体细胞示踪的良好材料,有较好的发展前景1.2 内源性标记物 与外源性标记物相比,内源性标记物通常是具有生物活性的蛋白质,可代谢、无毒、可透过各种屏障。因其基因片段较小,容易整合到大多数细胞基因组中,对宿主细胞的正常结构和功能影响不大，同时又能稳定表达和遗传,不存在稀释问题,有利于较长时间的细胞示踪观察。内源性标记物主要包括荧光素酶、荧光蛋白及 B-半乳糖酶(Bgalactosidase,B-gal)3类。1.2.1 荧光素酶 常用的荧光素酶有北美萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶[2]其荧光波长分别为 540~600nm 和460~540nm。荧光素酶基因导入细胞后能表达荧光素酶,通过注射底物就可观察被标记细胞的发光现象,实现细胞示踪。由于荧光素酶催化底物发光不需要激发光,其能量来自于酶的催化反应,发光只发生在活体细胞内,且具有一定组织穿透性,可以避免激发光造成的光噪现象。但是,荧光素酶的缺点是其催化发光容易淬灭,同时底物具有免疫原性,不适用于固定的标本等

1.2.2 荧光蛋白 荧光蛋白与荧光素发光方式不同,它不需要注射底物,其发光原理是较高能量的激发光能使其蛋白构象发生改变而产生荧光。目前发现有30 多种不同波长的荧光蛋白常见的有绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白和黄色荧光蛋白等。荧光蛋白由于荧光信号强，便于观察追踪,已经广泛应用于细胞示踪研究中，其中*常用的是细胞毒性*小的绿色荧光蛋

白。*近,利用一种重组酶系统(Cre/Loxp)构建的双荧光mT/mG转基因小鼠3因其能够在 Cre 酶作用下改变荧光颜色.提高细胞在组织内的分辨率而引起研究者的重视。然而,荧光蛋白的局限在于荧光发光必须依赖于激发光,因此其荧光信号易受周围组织于扰1.2.3 B-半乳糖 Bgal是 B-半乳糖酶基因(LacZ)的表达产物因其能催化乳糖水解当使用 Bgal的显色底物(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl B-D-galactopyranoside，X-Gal)时染色呈蓝色。利用这一特性可以实现观察和检测。但是由于它不能在活体细胞内观察而少采用。

综上所述，内源性标记较外源性标记操作复杂，需要将外源基因导人宿主细胞中,这可能会带来潜在性风险。不同的标记物(外源性的或者内源性的)都有各自的特点，应根据研究目的选择合适的标记物，并且还需要考虑实验动物种类、研究的组织类型以及标记物对细胞本身的影响等因素。

2细胞示踪标记方式

对于内源性标记物来说，将外源基因导人靶细胞是细胞示踪的关键。依其实现方式的不同可分为单一式标记和复合式标记两大类型。2.1 单一式标记细胞示踪 常见的单一标记包括转染、转导和基因打靶。

转染(transfection)是指真核细胞导入外源DNA而获得新的遗传标志的过程。主要包括电击法、磷酸钙法、脂质体介导法以及病毒介导法等。但由于转染对细胞伤害较大,可能影响细胞的正常生长发育,且导人的遗传标记在细胞内表达效率和稳定性不容易控制等问题.使得这种方法应用较少。

转导(transduction)是利用腺相关病毒、腺病毒、慢病毒或逆转录病毒等工具将外源基因整合到宿主细胞中。这种源于细菌遗传学的研究手段已经应用于哺乳动物的细胞示踪。目前一种较为成熟的、应用于细胞示踪的 RCAS 逆转录病毒体系可以实现在体内指定时间和特定部位控制表达标记!“]。与转染质粒相比,逆转录病毒转导方式对细胞毒性小,但是它只能标记有分裂能力的细胞,且有时也会发生表达沉默的现象基因打靶技术是以胚胎干细胞技术和同源重组技术为基础的一种定向基因编辑手段,能使修饰后的遗传信息在生物活体遗传并稳定表达。在细胞谱系示踪中应用的位点特异性重组酶(site specific recombinaseSSR)系统就是基因打靶技术发展起来的。SSR 主要包括来自酵母的 FLP/FRT 位点特异性重组系统和来自埃希氏大肠杆菌噬菌体 P1的 Cre/Loxp 重组酶系统[5,两者都能在特异性位点切制和连接 DNA，而Cre/Loxp系统重组效率更高。Joyner 等*早将 Cre/Loxp 系统应用于体内细胞谱系示踪研究,证实了 En2阳性细胞在小鼠大脑发育中的重要作用间。之后,为了解决特异性控制标记时间的问题,科学家对 Cre/Loxp 系统进行了改造,即通过雌激素受体的配体(如他莫昔芬 tamoxifen)调控 Cre 人核时间以实现对基因敲除时间点的控制。Barker 等[”就利用了这一升级后的系统,观察到肠道上皮干细胞在 60 天内特异性地表达含 G蛋白偶联受体的富含亮氨酸重复序列5( leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor5，Lgr5)基因*终证明了 Lgr5 基因为肠道干细胞的标志基因。所以,Cre/Loxp 系统的标记方式相比以往的细胞示踪手段,具有良好的靶向性,很大程度上避免了错误标记的问题。此外,Cre/Loxp 系统是对基因组进行编辑,能稳定遗传,所有表达过 Cre 的细胞及其后代的所有细胞都会被**地标记,这为细胞谱系示踪奠定了基础。目前,Cre/Loxp 系统已经广泛应用于细胞示踪研究

2.2 复合式标记细胞示踪 复合式标记方式比单标记方式能更准确地指示目的细胞的位置，这引起了研究者的极大兴趣。*早的复合式标记小鼠采用的是基于 Cre/Loxp 系统建立的 Z/AP 和 Z/EG 小鼠，它们能通过 LacZ 染色阳性或者增强绿色荧光蛋白(enhanced green fuorescent protein，EGFP)荧光来追踪被标记的细胞。另一种复合式标记小鼠是双荧光蛋白mT/mG小鼠,在 Cre 表达的情况下,mT/mG 小鼠相应组织或细胞由表达 tdTomato 的红色荧光转变成表达EGFP 的绿色荧光，由于 tdTomato 和 EGFP 都具有细胞膜靶向性,因此通过观察激发光条件下不同颜色的荧光就可以区别出未标记和已标记的细胞，从而极大提高了示踪的分辨度。此外,还有一种“Brainbow”多荧光标记系统是应用于斑马鱼的复合式标记系统,能使体内不同细胞显示不同颜色荧光来进行细胞区分和辨识。复合式标记系统以其高分辨度,特别是配合影像学的新进展，将成为今后主要的活体细胞示踪的标记手段。